Genome and molecular strategies for bovine babesiosis control
Juan Joel Mosqueda Gualitoa, Alfonso Falcón Nerib, Juan Alberto Ramos Aragónb, Germinal Jorge Canto Alarcóna, Minerva Camacho-Nuezc
a Licenciatura
en Medicina Veterinaria y Zootecnia, Facultad de Ciencias Naturales,
Universidad Autónoma de Querétaro, Avenida de las Ciencias S/N Col.
Juriquilla Santiago de Querétaro CP. 76230, Querétaro, México. Tel: 442
1991200, ext. 5386. joel.mosqueda@uaq.mx. Correspondencia al primer autor.
b CENID PAVET / INIFAP, Jiutepec, Morelos, México.
c Universidad Autónoma de la Ciudad de México, México, D.F.
RESUMEN
El
control de la babesiosis bovina en muchas partes del mundo está
restringido al tratamiento quimioterapéutico y al control de la
población de garrapatas con agentes acaricidas. No hay programas de
control basados en estudios de inmunidad de hato, control integral de la
garrapata y las enfermedades que transmite, ni vacunas contra la
babesiosis disponibles comercialmente. Para poder desarrollar estas
herramientas es necesario utilizar tecnologías que incluyan
conocimientos de genómica, proteómica y bioinformática, apoyadas en la
investigación de genes con potencial diagnóstico o vacunal. El estudio
de la función de los genes, y de la conservación o variabilidad son
indispensables para determinar su utilidad. Es necesario, primero
identificar los genes con potencial a incluirse en el desarrollo de
estas herramientas, y después, evaluar su variabilidad o conservación en
distintas poblaciones de parásitos. En segundo término, es necesario
seleccionar regiones específicas de estos genes, que cumplan la función
deseada, ya sean regiones conservadas o diferentes entre cepas.
Finalmente, es necesario utilizar el método adecuado de evaluación de
estos candidatos para el desarrollo de métodos de control adecuados. A
pesar de que hay ciertos avances en el estudio de genes de B. bovis, hay prácticamente nula información respecto a B. bigemina.
Es necesario aprovechar las nuevas estrategias genómicas y de
bioinformática para identificar nuevos genes con potencial diagnóstico y
de vacunación. El desarrollo de la ganadería mexicana está supeditado
al establecimiento e implementación de estas herramientas.
Palabras clave: Babesiosis bovina, Diagnóstico, Bioinformática.
ABSTRACT
The
control of bovine babesiosis around the world is restricted to
chemotherapeutic treatment and tick population reduction by acaricide
agents. There are no control strategies based on herd immunity studies,
programs on integral control of ticks and tick-transmitted diseases,
neither are commercially available safe vaccines against babesiosis. In
order to develop these tools it is necessary the use of genomics,
proteomics, and bioinformatics together with research on genes with a
potential use as diagnostics or vaccines. Studies on the function of
those genes and, the degree of conservation of variation are mandatory
to determine their usefulness. First, it is necessary to identify genes
with a potential use in the development of these tools and then,
evaluate their variation or conservation between different parasite
populations. Second, specific domains of those genes must be selected in
order for them to be used as desired, whether they are on conserved or
variable regions of those genes in different strains. Finally, the best
evaluation method for those genes must be employed to develop adequate
control methods. Although there is some research in the study of Babesia bovis genes, there is practically no information about B. bigemina.
Therefore it is necessary to take advantage of the genomics and
bioinformatics strategies to identify new genes as diagnostics and
vaccine potential. The development of the Mexican livestock depends upon
the implementation of these tools.
Key words: Bovine babesiosis, diagnostics, bioinformatics.
INTRODUCCIÓN
En
México como en muchos otros países con regiones ganaderas de clima
tropical y subtropical, existe una enfermedad de los bovinos que es
trasmitida por garrapatas. Esta enfermedad conocida como babesiosis
bovina, es causada por protozoarios del género Babesia y se
caracteriza por inducir procesos febriles en animales infectados, además
de causar anemia de tipo hemolítico, hemoglobinemia, hemoglobinuria y
en casos frecuentes, signos nerviosos y la muerte(1).
En México, la babesiosis bovina es causada por dos especies, Babesia bigemina y Babesia bovis, las cuales son trasmitidas por dos especies de garrapatas presentes en el país, Boophilus microplus y Boophilus annulatus (ahora pertenecientes al género Rhipicephalus)(2,3).
Se considera que el 75 % de la población bovina del país, estimada en
2004 en 31,760,962 cabezas, se encuentra en zonas infestadas de
garrapatas, por lo tanto expuestas a la enfermedad(4). Aunque
el costo ocasionado por la presencia de la garrapata y las enfermedades
que trasmite como la babesiosis y la anaplasmosis no ha sido estimado
recientemente, en 1975 éstas fueron de alrededor de 186 millones de
dólares, muchos de los cuales son atribuidos a las pérdidas en la
producción de carne y leche(5).
La
incidencia de la enfermedad clínica está determinada por diferentes
factores, por ejemplo, se ha demostrado que cuando la tasa de
inoculación de Babesia por garrapatas infectadas es adecuada, de
tal manera que se asegure que todos los becerros sean infectados durante
el período cuando están protegidos por la inmunidad pasiva e innata
(los animales jóvenes de hasta 8-9 meses de edad poseen una resistencia
natural, la cual les permite tener una reacción de menor severidad a la
enfermedad), entonces la presentación de la babesiosis clínica es mínima
y se alcanza una estabilidad enzoótica(6,7). Por otro lado,
si la tasa de inoculación es baja, de tal manera que no todos los
animales de un rancho se infectan cuando son jóvenes, algunos animales
permanecen susceptibles a la enfermedad, y cuando estos se infectan en
edad adulta, pueden sufrir una severa reacción clínica e incluso morir.
Dado que la tasa de inoculación no es estable en las áreas enzoóticas,
sino que varía con los cambios en las condiciones climáticas, o en las
condiciones de manejo de los animales (por ejemplo, intenso tratamiento
acaricida), un fenómeno denominado inestabilidad enzoótica puede
aparecer dentro de una zona endémica y provocar brotes severos de
babesiosis bovina(7). La detección temprana del estado
inmunológico de los animales en estas áreas de riesgo sería entonces un
elemento esencial en el control de la babesiosis. Para detectar estos
casos de riesgo se requieren métodos mejorados de diagnóstico que
permitan evaluar la estabilidad enzoótica de forma eficiente, y así
determinar si la vacunación es necesaria. Al mismo tiempo se requieren
vacunas eficaces y seguras que induzcan respuestas inmunológicas
protectoras en los bovinos inmunizados. A la fecha no existen métodos de
diagnóstico sensibles, automatizados y confiables, ni vacunas seguras
que confieran protección adecuada en México ni en la mayoría de los
países donde esta enfermedad es endémica(7,8).
Con la publicación de la secuencia del genoma completo de Babesia bovis(9), y la casi terminada secuenciación del genoma de Babesia bigemina por el Instituto Sanger (http://www.sanger.ac.uk/),
es posible ahora el estudio a nivel genómico de estos patógenos, y ha
proporcionado a la fecha información valiosa sobre las características
esenciales de la composición de su genoma y la comparación de éste con
el de otros protozoarios apicomplexa de importancia en salud humana y
animal, como aquéllos de los géneros Plasmodium y Theileria.
Esta información ha permitido la incorporación de diversos análisis con
programas de bioinformática que hacen posible la identificación de
genes nuevos, o que son homólogos en otras especies, además del estudio
de las proteínas predichas, su análisis comparativo y las
características físico-químicas, antigénicas y filogenéticas que
permiten un primer examen del potencial de estos genes putativos como
candidatos para su uso como agentes de diagnóstico o vacunal. Análisis
detallados son también posibles con la generación de etiquetas de
secuencias expresadas (EST) para Babesia bovis(10),
que permiten analizar aquellos genes que se expresan de forma específica
en los distintos estadios del ciclo de vida del parásito. Finalmente,
la realización de métodos de análisis del genoma completo de forma
masiva como los microarreglos que en breve estarán ya disponibles para
su uso(11).
Las
alternativas para desarrollar herramientas de control de la babesiosis
bovina basadas en tecnología recombinante no han sido muy exitosas. La
principal razón es, además de la variación de antígenos
inmuno-dominantes, el amplio arsenal de proteínas que tienen estos
protozoarios para invadir a sus células blanco. Por ejemplo, Babesia y Plasmodium spp., dos protozoarios Apicomplexa,
utilizan un mecanismo de invasión que involucra antígenos de la
cubierta superficial para adherirse a receptores en la membrana de los
eritrocitos. Esto es seguido de la liberación de antígenos de organelos
como las micronemas, que ayudan a la orientación del parásito para que
la porción apical quede en contacto con la membrana del eritrocito. Acto
seguido hay liberación de proteínas de las roptrías y de los cuerpos
esféricos, que facilita la invaginación de la membrana del eritrocito y
su penetración(12,13,14). Aunque existen diferencias entre
las distintas especies durante el proceso de invasión, lo cierto es que
las vacunas basadas en un sólo antígeno tienen pocas posibilidades de
conferir una protección adecuada, independientemente del tipo de
antígeno usado(15,16,17). Cuando dos o más antígenos se han
usado en combinación, los resultados han mejorado notablemente,
indicando que es necesaria una exposición a diferentes tipos de epítopes
presentes en diversos antígenos, ya sea usando antígenos nativos o
recombinantes(18,19,20). De estos resultados podemos inferir que existen epítopes que inducen respuestas humorales y celulares protectoras.
Algunos
de estos epítopes ya han sido mapeados por su capacidad de estimular
respuestas protectoras de tipo TH1. Al mismo tiempo, los esfuerzos para
generar antígenos recombinantes que induzcan respuestas humorales
neutralizantes, se han visto opacados por la variabilidad de los
epítopes expuestos, y por la presencia de epítopes inmunodominantes que
inducen una gran cantidad de anticuerpos no protectores. Una estrategia
para corregir estos problemas, es la selección de epítopes de las
proteínas involucradas en los distintos pasos del proceso de invasión,
con capacidad de inducir respuestas humorales y celulares protectoras.
Esta estrategia puede hacerse en dos pasos; primero, seleccionar los
epítopes conservados de proteínas que ya han sido probados por su
capacidad de inducir respuestas celulares Th, y segundo, la selección de
epítopes de proteínas de superficie que sean conservados y que induzcan
respuestas humorales. Una vez que se tenga este panel de epítopes,
estos pueden evaluarse como antígenos conservados que induzcan
respuestas inmunológicas protectoras (tipo TH1) e induzcan anticuerpos
que reconozcan epítopes conservados. Con estas dos características
pueden generarse métodos de diagnóstico inmunológico o bien candidatos
vacunales que ofrezcan nuevas alternativas para el control mejorado de
la enfermedad. Aquí describiremos las estrategias que nosotros y otros
grupos estamos realizando para desarrollar nuevos métodos para el
control de la enfermedad, incluyendo métodos de diagnóstico y antígenos
con potencial vacunal.
Búsqueda de nuevos genes con importancia en genomas de Babesia spp
Esta
estrategia se ha utilizado previamente para encontrar genes nuevos en
especies de patógenos que sean homólogos a genes previamente
caracterizados en otros microorganismos filogenéticamente similares(21).
Genes homólogos en función, usualmente comparten cierto grado de
identidad a nivel de secuencia, tanto nucleotídica como de aminoácidos, y
esta característica permite asumir que un elevado grado de identidad
entre estos genes en especies distintas permitirá resultados positivos
al realizar búsquedas BLAST en genomas secuenciados. Genes que codifican
proteínas con importancia en los procesos de invasión y escape de las
células hospederas, son blancos potenciales de bloqueo mediante
anticuerpos vacunales. Enzimas y otras proteínas metabólicas pueden ser
usadas como blancos de fármacos nuevos. Finalmente, proteínas con
funciones conservadas, y por lo tanto, secuencias conservadas, pueden
usarse como blancos de métodos de diagnóstico inmunológico y molecular.
En Babesia, hay un número elevado de genes homólogos en otras especies de protozoarios aplicomplexos mejor estudiadas como Plasmodium, Toxoplasma o Theileria. Por su parte Babesia bovis ha sido históricamente más estudiada que Babesia bigemina
y por lo tanto hay más genes identificados. La reciente secuenciación
de ambos genomas hace posible la aplicación de esta estrategia.
Análisis
e identificación de epítopes conservados de proteínas de superficie y
de organelos apicales de cepas de distintas regiones de México y el
mundo de Babesia bigemina y Babesia bovis.
Se han utilizado genes que codifican antígenos de organelos y de la cubierta de superficie de Babesia
spp, específicamente la proteína asociada a las roptrías 1a (RAP-1a),
el antígeno de la superficie del merozoito 1 y 2 (MSA-1, MSA-2), la
glicoproteína de superficie 45 (GP-45) y algunos citoplasmáticos como la
proteína de choque térmico 20 (HSP-20). Estudios hechos por nosotros y
otros han demostrado el potencial antigénico e inmunoprotector de estas
proteínas(22,23,24). Con las secuencias obtenidas de los
alelos de esos genes de aislados de México y otras partes del mundo, se
pueden realizar alineamientos múltiples de las proteínas predichas con
programas computacionales específicos (vector NTI Advance) para evaluar
la presencia de regiones conservadas(25). Los alineamientos
de cada proteína permiten identificar aquellas regiones de las proteínas
que son conservadas en todos los aislados y que estén expuestas en la
superficie, esto mediante el análisis de cada péptido obtenido por
análisis computacionales bioinformáticos como la antigenicidad
(Antigenic), además de la hidrofilicidad y la presencia de estructuras
secundarias (NNPREDICT), la ausencia de regiones transmembranales
(TMHMM) y de péptido señal (SignalP), al igual que la presencia de
epítopes B (BCEPred y ABCPred). Con la regiones obtenidas, entonces es
posible generar péptidos sintéticos por cada antígeno y usarse estos
para generar anticuerpos específicos contra cada péptido, como se ha
hecho anteriormente para proteínas de B. bovis(26).
Estos anticuerpos, después deben ser evaluados mediante western blot
(WB) e inmunofluorescencia indirecta (IFI). El objetivo principal es
verificar que los péptidos seleccionados generan respuestas
inmunológicas que forman anticuerpos que son específicos, y que tienen
la capacidad de bloquear la invasión de merozoitos. La meta de este
objetivo es contar con un panel de péptidos que cumplan con estos
requisitos y que sean evaluados posteriormente como candidatos de
diagnóstico o vacunales.
Genes de Babesia spp., con importancia vacunal y de diagnóstico encontrados mediante estrategias genómicas y de bioinformática
Desde la secuenciación de los genomas de Babesia bovis y Babesia bigemina,
se ha publicado la identificación de varios genes con potencial
importancia como agentes vacunales y de diagnóstico. Entre los más
sobresalientes están el antígeno de la membrana apical 1 de Babesia bovis,
la proteína relacionada a trombospondina (TRAP), los cuales fueron
identificados debido a la homología en su secuencia con los genes
respectivos en Plasmodium falciparum(21,27) Otros genes homólogos al antígeno principal de la superficie del esporozoito de Theileria annulata
(SPAG-1), el antígeno más estudiado en esta especie por su capacidad
como inmunógeno potencial, fueron identificados también en B. bovis(9). Se ha identificado el gen homólogo en Babesia bigemina
a TRAP (Petrig, R., comunicación personal). La caracterización de estos
genes a nivel de proteína predicha y su conservación entre cepas de
distintas zonas geográficas, permitirán su consideración como posibles
candidatos, ya sea de diagnóstico o bien como integrantes de nuevas
vacunas contra este patógeno.
Análisis de secuencias conservadas para la generación de péptidos sintéticos y su aplicación en el control de la enfermedad
Desde
hace mucho se han estudiado antígenos que fueron identificados por su
capacidad para inducir respuestas inmunológicas protectoras a bovinos
inmunizados. Algunos de estos antígenos incluyen aquellos localizados en
la membrana de la superficie del merozoito (MSA). Sin embargo, estos
antígenos han mostrado una gran variabilidad antigénica, que se traduce
en una ausencia de reconocimiento por anticuerpos contra cepas con MSA
distintos(28,29) y que compromete su uso como antígenos
vacunales. Sin embargo, un análisis bioinformático más detallado de las
secuencias de estos genes obtenidas de cepas de distintas zonas
geográficas, pueden permitir identificar regiones conservadas que se han
usado para generar péptidos sintéticos específicos. Estos péptidos
pueden entonces usarse como agentes vacunales, y que al ser aplicados
como inmunógenos en bovinos susceptibles, induzcan anticuerpos que
neutralicen el proceso de invasión y por lo tanto eviten el
establecimiento de la infección. Estudios recientes preliminares han
mostrado resultados promisorios, y la aplicación de esta estrategia con
otros antígenos está siendo evaluada actualmente(30).
De los genes nuevos a las proteínas predichas: aplicaciones y perspectivas
Una
vez identificadas las secuencias que reúnen los requisitos de un marco
abierto de lectura (ORF), un primer paso consiste en verificar si estos
ORFs son genes verídicamente. Una forma de verificación es evaluar la
trascripción de estos ORF's: esto es sencillo y rápido al diseñar
primers o iniciadores directamente de las secuencias obtenidas (exones),
estos primers son utilizados para comprobar la presencia de trascritos
en muestras de ARN mensajero, indicador de que la secuencia seleccionada
es un gen que se transcribe y con potencial. Asimismo puede obtenerse
mediante informática la secuencia predicha de las proteínas codificadas
por estos genes, e información adicional que permita saber si estas
proteínas son de membrana y la presencia de epitopes accesibles al
sistema inmunológico del hospedero. Con el alineamiento de varias de
estas secuencias de cepas distintas, es posible evaluar el grado de
conservación de los genes y sus proteínas, y conocer las regiones
conservadas o variables. A nivel de secuencias nucleotídicas, las
regiones variables pueden utilizarse para el desarrollo de marcadores
que permitan discriminar cepas mediante técnicas moleculares, una
técnica muy requerida en la actualidad por su importancia
epidemiológica. Las secuencias conservadas a nivel de aminoácidos
permitirán el desarrollo de péptidos conservados que pueden ser
utilizados como herramientas de diagnóstico al ser incorporados en
técnicas de diagnóstico inmunológicas como la ELISA. Los péptidos
también pueden formar parte de vacunas que generen respuestas
inmunológicas contra esas regiones conservadas de las proteínas, y al
ser inmunizados a bovinos, protejan contra desafíos heterólogos. La meta
es producir herramientas de control mejoradas contra la babesiosis
bovina que, ayudadas por las tecnologías genómicas y de bioinformática,
ayuden a prevenir y controlar esta enfermedad en regiones endémicas de
México y el mundo.
CONCLUSIONES
La babesiosis bovina causa enormes pérdidas económicas a la ganadería en las regiones donde está presente.
Los
métodos actuales de control no son suficientes ya que no hay vacunas
disponibles que sean eficaces, y los métodos de diagnóstico actuales son
poco sensibles.
La
genómica y la bioinformática son herramientas que permiten analizar
genomas completos ya secuenciados, y buscar nuevos genes con potencial
diagnóstico y vacunal, e incorporarlos para generar nuevos métodos de
diagnóstico, sensibles y automatizados, y vacunas eficaces que ayuden a
controlar la enfermedad en México y el mundo.
AGRADECIMIENTOS
Este trabajo es financiado por los proyectos: INCO 003691 y PROMEP-PTC-108 .
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